건강한 세포를 분리하여 손상조직에 이식할 충분한 양으로 증폭시킨 후, 시트(sheet) 형상으로 회수할 수 있는 세포배양 플랫폼이 소개됐다.
배양조건 그대로 배양액(buffer)만 교체, 세포수확 과정에서의 손상을 줄여 이식 후 손상조직의 재생효율을 높일 단초가 될 것으로 기대된다.
한국연구재단은 KAIST 임성갑 교수(생명화학공학과) 및 연세대학교 조승우 교수(생명공학과) 연구팀이 온도변화 없이 단시간 내 세포 시트를 배양기판으로부터 손상없이 분리하는 방법을 개발했다고 밝혔다.
백지응 박사, 박현지 박사, 조영학 박사과정 학생이 제1저자로 참여한 이번 연구의 성과는 국제학술지‘어드밴스드 머티리얼스’지에 3월 11일 게재 되었다.
피부나 연골 등 조직손상이 심한 부위에 생체이식을 하려면 체외에서 해당 세포를 배양하여 증식시키는 과정이 필요하다. 이 때 평면형태의 기판 위에 시트 형태로 단단히 접착되어 자라는 세포시트를 손상 없이 떼어내는 것이 중요하다.
기존에는 배양온도를 세포에 적합한 37oC에서 20oC 이하로 낮춰 20분 이상 노출, 기판을 친수성으로 바꿔 세포시트를 분리하는 방식 등이 시도되었다. 하지만 세포에 스트레스가 되는 급격한 온도저하와 소요시간으로 인해 세포시트의 손상이 우려되었다.
이에 연구팀은 배양기판 표면을 생체적합성 고분자로 코팅, 세포와 배양기판 간의 접착력을 정밀히 조절할 수 있도록 표면을 개질하였다. 이를 통해 세포가 자라는 데 필요한 영양분이 든 배양액을 교체하는 간단한 방법으로 온도나 산성도 변화 없이 100초 내에 배양하던 세포를 시트형상으로 회수하는 데 성공했다.
세포와 세포, 그리고 세포와 세포외기질 간의 부착에 중요한 역할을 하는 세포막 단백질인 인테그린과 배양기판 표면 사이의 접착이 양이온에 의존한다는 점에 착안하여 양이온이 없는 배양액을 처리, 세포시트를 신속하게 분리할 수 있었다.
실제 인간성체줄기세포, 쥐근아세포, 인간피부섬유모세포 등 여러 세포를 파종(seeding)하여 배양한 후, 배양환경 그대로 시트형태로 수확해 냈다. 이렇게 얻은 세포의 세포주기와 DNA 함량은 정상 범위였으며, 특히 줄기세포시트의 경우 재생효과물질의 분비가 2배 이상 증가했다.
나아가 수확한 세포시트를 적층, 당뇨병성 궤양 생쥐모델에 이식하자 상처부위 면적이 급격히 감소하고 표피의 두께가 증가하는 등 상처가 빠르게 치유되었다. 허혈성 생쥐모델에 이중층 세포시트를 이식하자 혈관형성 촉진과 혈류 흐름 증가가 나타났으며 피부궤사와 허혈성 사지 손실이 완화되었다.
교신저자인 KAIST 이은정 연구교수는“개발한 세포시트 수확방법을 토대로 향후 심근세포, 위장세포, 각막세포 등 여러 조직의 세포시트를 활용한 조직재생 연구를 수행할 계획”이라고 밝혔다. 이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 기초연구 사업 (중견연구) 및 선도연구센터지원사업 등의 지원으로 수행되었다.
그림 1. 온도변화 과정이 필요 없는 세포시트 제작 개요도
iCVD 고분자 공중합체 분율 조절을 통해 표면 자유에너지를 제어, 세포-표면의 부착력을 제어하고 2가 양이온 농도 조절을 통해 세포시트 탈착이 유도되도록 하였다. (제공 : KAIST 임성갑)
그림 2. 고분자 표면에서 비온도 감응형으로 제작된 세포시트 회수효율
a) 고분자가 코팅된 표면(노란색)에서만 세포 시트가 형성되는 것을 확인
b) 다양한 종류의 세포주로부터 세포시트가 형성되는 것을 확인
c) 세포 시트 분리 전/후 세포외기질 및 세포-세포 접합 부위의 염색 이미지 F-actin (적색), N-cadherin (녹색) 및 Fibronectin (분홍색)
d) 세포 시트 분리 전/후 세포의 Live/dead 이미지, (제공 : KAIST 임성갑)
그림 3. 당뇨성 허혈 생쥐모델에의 세포시트 이식 효과 검증
비온도감응형 pDV 표면과 기존의 온도감응형 pNIPAm 표면에서 각각 제작된 세포 시트를 당뇨성 허혈 모델에 이식 21일 후 치료 효과를 검증하였다
(a, c) 다리 재생 능력 비교 사진 및 정량 분석 : pDV-세포시트를 이식한 그룹에서만 완전히 회복되어 허혈성 다리손실이 없음을 증명.
(b, d) 혈류량 분석을 통한 혈관 재생 능력 치료 효과 비교 및 정량 분석 : pDV-세포시트를 이식한 그룹에서 허혈성 조직으로의 혈액공급이 증가되고 있음을 증명. (제공 : 연세대학교 조승우)
그림 4. KAIST 연구진 사진(제공 : KAIST 임성갑)
왼쪽부터 유승정 박사, 이은정 연구교수 (교신저자), 임성갑 교수 (교신저자), 조영학 (제1저자), 백지응 박사(제1저자), 이민석
그림 5. 연세대학교 연구진 사진(제공 : 연세대학교 조승우)
왼쪽부터 조승우 교수 (교신저자), 박현지 박사 (제1저자), 이종승
